INVESTIGA POR TU CUENTA: RT-qPCR ¿SARS-CoV2 o el virus de la gripe?
Después de un año y medio de pandemia, sigue habiendo dudas con la técnica por excelencia para la detección de SARS-CoV2: la RT-qPCR. Como sigue habiendo dudas, hemos diseñado un sencillo experimento para responder a la pregunta:
¿Dan las RT-qPCRs positivo cuando sólo tienes gripe?
La RT-qPCR es una técnica que permite detectar si hay o no un cierto material genético en una muestra dada y en qué cantidad. Desde el principio de la pandemia ha habido dudas por un sector de la población que aseguraba que la PCR, indudablemente, daba positivo cuando tenías gripe. ¿qué hay de cierto en esto? ¿Podemos comprobar por nuestros propios medios si esto es cierto o no?
La respuesta es SI, ¡podemos! El ejercicio entero no tarda más de 10 minutos. Te recomendamos que abras una hoja de word para ir copiando los resultados de los diferentes pasos, te va a hacer la vida más sencilla.
Atención: Como es de esperar, el siguiente material no es sencillo de comprender, pero pensar que "hacer vuestras propias investigaciones" es sencillo sólo significa que o no lo estás haciendo bien o te estás engañando a ti mismo.
La RT-qPCR
Atajo: Si sabes cómo funciona una RT-qPCR, qué son los cebadores, etc.. pasa al paso 1, si no atiende a esta breve explicación!
En esta prueba lo que le da esta especificidad son los cebadores (también llamados primers) que son unas pequeñas secuencias de ADN (de unos 20 nucleótidos) que se usan para que se peguen a una porción de interés del ADN de la muestra y permiten que se multiplique (para poder detectarlo).
Estos cebadores necesitan ir en parejas que lean la hebra de ADN en "direcciones contrarias" y estas parejas no estar muy alejadas la una de la otra, ya que sólo así se consigue que conforme avancen los ciclos, el material genético crezca de forma exponencial.
En el primer ciclo nuestros cebadores se pegarán a la muestra (sólo si hay complementaridad) y permitirán crear una copia de una porción de la muestra. Al final del ciclo los separaremos y volveremos a empezar.
En el segundo ciclo los cebadores se volverán a pegar y pueden pegarse a la muestra original y a la copia que se hizo en el ciclo anterior.
Ojo: Sólo pueden hacer esto si los cebadores están suficientemente cerca el uno del otro (Ya que la cantidad de ADN copiada será pequeña) y si están en las direcciones correctas (ya que si no, cada uno copiará en una dirección opuesta). ¿Cómo de cerca? Lo más cerca posible, intentando que no haya una separación mayor de unos pocos cientos de bases. Si no queda claro, podéis ver aquí un video de 3 minutos de una PCR normal que más o menos os puede ayudar a entender por lo de los cebadores. Si te ha quedado claro: sigue.
Además a esta reacción, hay que añadirle una sonda fluorescente que es la que nos va a ir indicando la cantidad de muestra que tenemos.
- Los cebadores están cerca el uno del otro, y en la dirección correcta: si están muy lejos o invertidos no habrá reacción y el resultado será negativo.
Paso 1: Encontrar cebadores
Las secuencias de los cebadores no son secretas y suelen acompañar guías para el diagnóstico, artículos científicos, etc... Nosotros usaremos las secuencias recomendadas por el CDC: AQUÍ.
Aunque también podeis, por supuesto, usar cualquiera publicada como aquí en eurosurveillance, o en cualquier artículo científico como estos que os añado aquí, aquí, aquí, aquí o incluso aquí. Pero en realidad podéis utilizar cualquier artículo que incluya la secuencia de los cebadores utilizados.
2019- nCoV_N2-F : TTA CAA ACA TTG GCC GCA AA
2019- nCoV_N2-R: GCG CGA CAT TCC GAA GAA
Podeis elegir el que querais del artículo o base de datos que querais, pero recordad bien contra qué gen está dirigido (Seguramente haya una letra E, N, S o RP en ellos). En el caso del que hemos elegido hay una N que nos indica que está dirigido como hemos dicho antes al gen N de SARS-CoV2.
Una vez elegidos hay que hacer un cambio. Como hemos mencionado antes, uno de los cebadores va en la dirección opuesta, por lo que hay que "redireccionarlo" para poder compararlo con la secuencia de referencia. Lo puedes hacer fácilmente pegando la secuencia aquí.
Una vez que tengamos la secuencia hay que ponerlo en un "lenguaje" llamado FASTA, que es como un código que nos permitirá usarlo en los diferentes programas de análisis genético que vamos a utilizar. Es tan sencillo como poner ">Cebador_LETRA" al principio y añadir en la línea de abajo la secuencia. En mi caso:
>Cebador_F
TTA CAA ACA TTG GCC GCA AA
>Cebador_R
TTCTTCGGAATGTCGCGC
Copiad bien esas secuencias en ese formato, porque las usaremos al final.
Para los pro: Como veis Cebador_R es justamente el inverso-complementario de 2019- nCoV_N2-R : es decir, leído de atrás hacia delante es la letra complementaria (Cambiando A <-> T y C <-> G).
Paso 2: Una vez que tenemos el cebador, ver donde puede pegarse.
Una vez que tenemos los cebadores elegidos, podemos compararlos directamente con el genoma de SARS-CoV2 para verificar si la secuencia que busca el cebador está incluida en su genoma, lo que es necesario para que la RT-qPCR lo detecte usando ese cebador.
Para ello tienes que acceder al genoma de SARS-CoV2 que lo puedes buscar aquí.
Puedes buscar "SARS-CoV2" para buscar todo el genoma o puedes buscar sólo un gen específico. Yo buscaré "SARS-CoV2 gene N" ya que sé a qué gen va dirigido mi cebador (Evidentemente, si has escogido un cebador dirigido para otro gen, busca ese gen).
Una vez que lo hayas buscado tu objetivo es buscar la secuencia de ese gen en formato FASTA (el formato que anteriormente habíamos dicho, que es el que leen los programas para comparar). Lo conseguiremos pulsando en el nombre y luego buscando en la página que nos sale "FASTA" (ver imagen). Copiaremos la secuencia en el documento word que teníamos abierto: OJO! Incluye el nombre desde el principio (A partir de ">NC_...") para poder tenerlo en el formato adecuado.
Atajo: Si no te apetece buscarlo o no consigues encontrar las secuencias, aquí tienes una página con accesos más directos o aquí tienes los enlaces directos para: el gen N, el gen E y el gen S.
Ahora que tenemos nuestros cebadores elegidos y nuestra secuencia a comparar podemos usar un programa que compara las secuencias llamado Clustal Omega:
En este programa introduciremos nuestra secuencia de SARS-CoV2 y la de nuestros cebadores, todo en formato FASTA (Ver foto), porque si no no funciona el programa. Una vez introducido como en la foto que sigue, puedes darle a "submit" al final de la página.
El resultado nos indicará si es idéntico o no a una zona de ese gen. Si los cebadores están bien diseñados, como podemos ver en la parte de abajo de la imagen anterior primero debe aparecer el Cebador_F y después de un espacio pequeño, el Cebador_R (si no estarán al revés, y no habrá reacción).
En mi caso, el resultado es que el cebador_F aparece primero y es idéntico a una zona de 20 nucleótidos, luego hay un pequeño espacio y aparece el cebador_R. Por lo que estos dos cebadores están muy bien diseñados para detectar la proteina N de SARS-CoV2.
Paso 3: De acuerdo, detectamos SARS-CoV2, pero, ¿detectamos otro virus también?
Para responder a esta pregunta hay dos formas de abordarlo:
Primero: Si sospecho ya de un microorganismo.
Si creo que mis cebadores pueden detectar otro virus, en vez de compararlos con SARS-CoV2, los debo comparar con el genoma completo de otro virus.
Puedes retomar el paso 2 buscando el virus que quieras, acuerdate de buscar la palabra "FASTA" para conseguir la secuencia. Aquí te ponemos algunos "sospechosos habituales" para que los compares:
Los otros 6 coronavirus que afectan a humanos: Los más comunes HCov-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, HCoV-OC43 y los dos que causaron brotes con muy alta letalidad (pero poca transmisibilidad) a principios de este siglo MERS, SARS.
Para comparar con el virus de la gripe debéis comparar por separado cada uno de sus 8 segmentos. Tenéis aquí secuencias del virus de la gripe, podéis darle a cualquiera de ellas y pulsar (+) justo antes del nombre. Se os abren una lista y para encontrar la secuencia debes pulsar el número "NC_....."
Es normal, que en otros coronavirus pueda parecer que haya algo de parecido entre una secuencia de ellos y los cebadores (ya que vienen todos del mismo ancestro común). Sin embargo acordaos que esta reacción sólo funcionará bien si :
- El cebador coincide perfectamente (o casi) con la secuencia: Si no, podría dar reacciones poco específicas y, depende de cómo de diferente sean las secuencias, no dar ningún tipo de reacción.
- Aparecer el cebador F antes del R.
- Que la separación entre F y R sea de pocas decenas de bases.
En el caso del ejemplo escogido, vemos que en ninguno de los 4 primeros coronavirus habría detección cruzada y por supuesto, tampoco con el virus de la gripe. Sin embargo, sí que podría haber detección cruzada con el virus del SARS original o SARS-CoV1 (Aunque hay alguna diferencia en algún nucleótido, pero seguramente no tan importante como para no dar reacción) e incluso podría dudarse si habría o no reacción en el caso del MERS, aunque seguramente no la hubiese. Por lo tanto no sería una buena pareja de cebadores para distinguir SARS-CoV1 de SARS-CoV2, pero sí sería una buena pareja de cebadores para distinguir SARS-CoV (1 ó 2) del resto de virus.
En este caso no es un problema grave ya que:
- Hace años del último brote de SARS-CoV1, por lo que no es un virus que circule actualmente
- Tengas SARS-CoV1 o SARS-CoV2, estamos en las mismas, necesitas aislamiento y atención médica urgente (sobre todo si es SARS-CoV1, que tenía una letalidad del 10%).
- Hay un sistema centinela que secuencia muestras de virus detectados en pacientes (así se va detectando la prevalencia de las diferentes variantes), si hubiese SARS-CoV1 circulando, lo sabríamos.
Esto viene seguramente de lo que comentabamos anteriormente de las propiedades fisicoquímicas que nos limitan a la hora de diseñar unos cebadores. La parte positiva es que, al hacer años del último brote de SARS-CoV1, al tener un sistema centine
Segundo: Si no tengo ni idea de qué buscar
Este método es útil sobre todo para secuencias más largas, pero igualmente puede arrojarnos ya alguna pista con una secuencia más corta como la de un cebador:
Puedes usar la herramienta BLAST, que compara la secuencia que tú elijas con una base de datos global.
Para ello tienes que introducir la secuencia de uno de los cebadores que hayas elegido (en el formato FASTA que hemos visto al final del paso 1) en: "Enter accession number(s), gi(s) or FASTA sequence(s)".
Y pulsar sobre "BLAST" abajo del todo.
Cuando el programa haya comparado tu secuencia con las bases de datos, te arrojará una lista con lo que es muy similar a tu secuencia.
En mi caso, el resultado es que todo lo que se le parece son secuencias de muestras de SARS-CoV2. Para ver si se parece a algo que no sea SARS-CoV2 puedes excluir ese virus de la búsqueda en el menú de la derecha y te arrojará otros organismos en los que esa secuencia o similar puede estar presente.
Conclusión de la investigación
A partir de ahora podéis "jugar" a comparar secuencias entre sí de cebadores y microorganismos.
Cabe destacar 3 cosas:
1- Normalmente las RT-qPCRs intentan hacerse con dos parejas de cebadores para dos regiones distintas. Es decir, si con una pareja habéis visto que no conseguís encontrar una secuencia que no sea de SARS-Cov2, imaginaos esto con dos secuencias. Esto le da más fiabilidad al ensayo.
2- El resultado de una RT-qPCR es analizado por un experto. El informe del análisis puede detectar si la reacción ha sido inespecífica, si ha habido un problema con la muestra, si una pareja de cebadores ha dado señal y otra no, etc... Estas cosas pueden ocurrir, por eso algunos que os habeis hecho PCR ha salido como resultado: no conclusivo. Suele deberse a que los resultados no son "limpios".
3- Finalmente, cabe destacar que esto es una aproximación teórica pero antes de validar cualquier test que nos ayude a diagnosticar estas preguntas ya se las han hecho los científicos. En todo test se mide :
Sensibilidad: Si eres positivo, qué posibilidades tengo de que el resultado sea positivo. Para la RT-qPCR está por encima del 85% (Lo restante hasta llegar a 100% serían falsos negativos)*.
Especificidad: Si eres negativo, que posibilidad tengo de que el resultado sea negativo. Para la RT-qPCR está por encima del 99% (lo restante hasta 100% son los falsos positivos)*.
*Según estos análisis
Moraleja, si alguien te dice que la RT-qPCR detecta el virus de la gripe, te miente. Y si te miente en eso, desconfía de todo el resto de cosas que te dice.
Ni se parece el genoma, ni los cebadores de la RT-qPCR hibridarían con el virus de la gripe, ni se parece en la estacionalidad, ni absolutamente nada.